Real-Time PCR预混液(染料法)是采用SYBR Green I嵌合荧光法进行Real-Time PCR的专用试剂。产品中预先混有Real-Time PCR反应所需合适浓度的SYBR Green I，是一种2×浓度的PCR预混反应液，反应液配制十分简单方便。
本制品采用了独特的双组分热启动DNA聚合酶(化学修饰的HotStar Taq DNA聚合酶和抗体修饰的Taq DNA聚合酶)，配合精心优化buffer体系，具有高扩增效率，高扩增特异性和宽广的可信范围的特点。
- 2×SuperReal SYBR PCR Mix Plus采用了独特的双组分热启动DNA聚合酶(化学修饰的HotStar Taq DNA聚合酶和抗体修饰的Taq DNA聚合酶)，从而构成酶活自动调节系统，配合精心优化buffer体系，具有高扩增效率，高扩增特异性和宽广的可信范围的特点。
- 本制品Buffer体系平衡了K+和NH4+的比例，还特别添加了独特的H-Bond因子，能协同调整反应体系中的氢键作用力，使引物模板退火条件更加严谨，反应的专一性增强，重复性更好。
- 2×SuperReal SYBR PCR Mix Plus中预混有SYBR Green I，PCR反应液配制时，只需加入模板、引物、灭菌蒸馏水便可进行Real-Time PCR反应，操作简单方便。
- 本制品附带ROX Reference Dye，用于消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差，方便客户针对不同型号荧光定量PCR仪时选择对应浓度使用。
本制品采用了独特的双组分热启动DNA聚合酶进行PCR扩增，通过检测反应进程中SYBR Green I的荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的。本制品中双热启动酶构成了独特的酶活自动调节系统。酶活自动调节系统是由化学修饰的HotStar Taq DNA聚合酶和抗体修饰的Taq DNA聚合酶组成。其中HotStar Taq DNA聚合酶占绝大部分比例，其聚合酶活性的激活是严格依赖于95℃高温的一个缓释过程，而抗体修饰Taq DNA聚合酶则在95℃高温下完全激活。经过95℃条件下孵育15min激活大部分HotStar Taq DNA聚合酶，进入PCR循环后，每经过一轮95℃条件下变性，即可重新激活一部分HotStar Taq DNA聚合酶。HotStar Taq DNA聚合酶独特的酶活缓释机制使其可以与抗体修饰的Taq DNA聚合酶构成独特的酶活自动调节系统。PCR反应初期，完全激活的抗体修饰的Taq DNA聚合酶可以协同已经激活的HotStar Taq DNA聚合酶达到优化酶活状态，而在整个PCR反应过程中，每一轮新释放的HotStart Taq DNA聚合酶活力刚好可以弥补因热变性所导致的部分酶活损失。因此，2×SuperReal SYBR PCR Mix Plus在整个PCR反应过程始终保持优化的DNA聚合酶活力，配合精心优化Buffer体系，从而可以获得高扩增效率，高扩增特异性和更加广泛性的模板适应性。
| 组分 | 125T | 500T | 5000T |
| 2×SuperReal SYBR PCR Mix Plus | 1.25mL | 4×1.25mL | 40×1.25mL |
| 50×ROX Reference Dye | 250μL | 1mL | 10×1mL |
| RNase-Free ddH2O | 2×1mL | 5×1mL | 50×1mL |
保存：-20℃，避光，有效期1年。
本制品于-30~-15℃可保存12个月。收到本制品后，请立即置于-30~-15℃避光保存。从-30~-15℃取出使用时，将冻存的2×SuperReal SYBR PCR Mix Plus和50×ROX Reference Dye融解，然后轻轻颠倒混匀，待溶液完全均一后再行使用。如解冻后没有使用，须彻底混匀后重新冷冻(在解冻过程中盐会出现分层现象，未混匀进行冷冻，盐晶体的析出将会对酶造成损害)。如需一段时间内经常取用，可在2～8℃条件下储存3个月。避免反复多次冻融。
- PCR反应的预变性条件必须设定为95℃ 15min，用以充分激活热启动酶。
- 本制品中含有荧光染料SYBR Green I，保存本制品或配制PCR反应液时应避免强光照射。
- 如果试剂没有混匀，其反应性能会有所下降。使用时请上下颠倒轻轻混匀，请不要使用振荡器进行混匀，尽量避免出现泡沫，并经瞬时离心后使用。
- 引物纯度对反应特异性影响很大，建议使用PAGE级别以上纯化的引物。
- 引物终浓度为0.3μM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。如果需要进一步优化，可以在0.2～0.5μM范围内调整引物浓度。
- 20μL反应体系中，基因组DNA或cDNA模板的使用量一般小于100ng，逆转录产物作为模板时，使用量应不超过PCR体系终体积的20%。
- 建立Real-Time PCR反应体系
- 溶解2×SuperReal SYBR PCR Mix Plus(如果保存在-30~-15℃)，50×ROX Reference Dye，模板，引物和RNase-Free ddH2O，并将所有试剂在室温下平衡并彻底混匀。
- 建议置于冰上进行Real-Time PCR反应液的配制。
成分 50μL体系 25μL体系 20μL体系 终浓度 2×SuperReal SYBR PCR Mix Plus 25μL 12.5μL 10μL 1× 正向引物(10μM) 1.5μL 0.75μL 0.6μL 0.3μM 反向引物(10μM) 1.5μL 0.75μL 0.6μL 0.3μM cDNA模板 － － － -ng-pg 50×ROX Reference Dye 根据PCR仪选择添加或不添加 RNase-free ddH2O 至50μL 至25μL 至20μL - - 引物终浓度为0.3μM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。扩增效率不高时，可增加PCR反应体系中的引物浓度；发生非特异扩增时，可适当减少PCR反应体系中的引物浓度。需要进一步优化引物浓度的，可以在0.2～0.5μM范围内调整。
- 溶解2×SuperReal SYBR PCR Mix Plus(如果保存在-30~-15℃)，50×ROX Reference Dye，模板，引物和RNase-Free ddH2O，并将所有试剂在室温下平衡并彻底混匀。
- 进行Real-Time PCR反应
- 建议采用两步法PCR反应程序进行反应，当出现模板浓度过低引起非特异性扩增，引物Tm值较低导致的扩增效率低下或扩增曲线重现性不佳等现象时，可尝试进行三步法扩增反应。
- 两步法反应程序：
阶段 循环 温度 时间 内容 荧光信号采集 预变性 1× 95℃ 15min 预变性 否 PCR反应 40× 95℃ 10sec 变性 否 60～66℃Δ1 20～32sec* 退火/延伸 是 熔解曲线分析 - 三步法反应程序：
阶段 循环 温度 时间 内容 荧光信号采集 预变性 1 95℃ 15min 预变性 否 PCR反应 40 95℃ 10sec 变性 否 50～60℃Δ2 20sec 退火 否 72℃ 20～32sec* 延伸 是 熔解曲线分析
注Δ2：通常引物退火温度比引物的解链温度(Tm)低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度。
注*：使用不同型号仪器进行时间设定时，请按照仪器说明书要求进行实验操作，几种常见仪器的时间设定见下表：使用时Roche LightCycler/LightCycler 480请设定在20sec。 使用ABI 7500 Fast/7900HT/7900HT Fast/ViiA 7/StepOne/StepOnePlus时请设定在30sec。 使用ABI 7000和7300时请设定在31sec。 使用ABI 7500时请设定在32sec。 - 两步法反应程序：
- 盖上反应管，轻柔混匀。可短暂离心，确保所有组分均在管底。
- 将反应体系置于荧光定量PCR仪中，开始反应。
- 建议采用两步法PCR反应程序进行反应，当出现模板浓度过低引起非特异性扩增，引物Tm值较低导致的扩增效率低下或扩增曲线重现性不佳等现象时，可尝试进行三步法扩增反应。
- 以使用ABI 7500 Real Time PCR扩增仪为例，进行扩增效率优化时，可以按照下表中所示优化方案1或优化方案2的反应条件进行反应：
基本反应程序 优化方案1
(增加两步法延伸时间进行优化)优化方案2
(使用三步法进行PCR反应)循环 温度 时间 时间 温度 时间 1× 95℃ 15min 15min 95℃ 15min 40× 95℃ 10sec 10sec 95℃ 10sec 60℃ 32sec 32～60sec 55℃ 30sec NA 72℃ 32sec - 以使用ABI 7500 Real Time PCR扩增仪为例，进行特异性优化的参考方案：
基本反应程序
(提高两步法退火温度)特异性优化方案 循环 温度 时间 温度 时间 1× 95℃ 15min 95℃ 15min 40× 95℃ 10sec 95℃ 10sec 60℃ 32sec 60～64℃ 32sec
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| 图1．扩增曲线，以单链cDNA为模板，用2×SuperReal SYBR PCR Mix Plus进行8对不同检测体系的qPCR实验，之后进行熔解曲线分析。结果显示，熔解曲线均为单一峰，未发现非特异性扩增和引物二聚体产生。 | 图2．熔解曲线，cDNA的合成使用反转录试剂盒 |
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| 图3．熔解曲线分析，同一反应体系，使用2×SuperReal SYBR PCR Mix Plus的熔解曲线仅有单一峰，为特异性扩增产物，其Tm值为83℃；使用国外A公司试剂除了特异性扩增产物外，还出现了引物二聚体。引物二聚体的Tm值一般在75℃左右。 |
进行RT-qPCR反应时的操作建议：
进行RT-qPCR反应时，有三种cDNA第一链合成试剂盒可以选择，分别是反转录试剂盒(WH0234)，cDNA第一链合成反应预混液(货号：WH0235)和cDNA第一链合成试剂盒(货号：WH0099)。其中，反转录试剂盒(货号：WH0234)是专为两步法RT-qPCR第一步实验配制的，具有高灵敏度的RT-qPCR反应系统，可以从微量的总RNA或poly (A)+ RNA合成第一链cDNA。该试剂盒中使用的逆转录酶King Reverse Transcriptase与通常使用的Moloney鼠白血病病毒来源的M-MLV和鸟成髓细胞病毒来源的AMV不同，是一种使用大肠杆菌工程菌进行重组表达的全新高效逆转录酶。该酶能够高效反转录多种RNA模板，高效地将RNA反转录成cDNA第一链。
以反转录试剂盒(货号：WH0234)为例，下列操作步骤适用于模板量为50ng～2μg的总RNA。
- 将模板RNA在冰上解冻；5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10×King RT Buffer、RNase-Free ddH2O在室温(15～30℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。
- 以下操作步骤请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先配制成Mix，然后再分装到每个反应管中。
- 按照表1的gDNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育3min。然后置于冰上放置。
- 按照表2的反转录反应体系配制混合液。
- 将反转录反应中的Mix加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。
- 42℃，孵育15min;95℃，孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA可用于后续实验，或低温保存。
- 进行PCR反应：表1．gDNA去除反应体系
成分 用量 5×gDNA Buffer 2μL Total RNA - RNase-Free ddH2O 至10μL 表2．反转录反应体系成分 用量 10×King RT Buffer 2μL Quicking RT Enzyme Mix 1μL FQ-RT Primer Mix 2μL RNase-Free ddH2O 至10μL
进行Real Time PCR反应时，PCR引物的设计非常重要。设计PCR扩增效率高，反应特异性强的引物可以参考以下要求。
| 引物长度 | 18～30个碱基 |
| GC含量 | 40～60% |
| Tm值 | 引物软件都可以给出Tm，与引物长度、碱基组成、引物使用缓冲的离子强度有关。 上下游引物的Tm值要尽量接近。 简单的Tm计算公式：Tm=4℃(G+C)+2℃(A+T)。 一般采用较引物Tm值低5℃作为PCR退火温度。 提高退火温度可以增加PCR反应的特异性。 |
| 引物及PCR 扩增产物序列 | PCR扩增产物适宜长度在80～200bp之间。 尽量避开在模板的二级结构区域设计引物。 避免上下游引物3'端之间形成2个或以上的互补碱基以减少引物二聚体的形成。 引物3'端碱基不能有多于3个连续的G或C。 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构。 避免引物3'末端碱基为T。 引物序列中A、T、G、C要尽量均匀分布。 |
- 无扩增信号或扩增曲线起峰晚或仅有引物二聚体
问题 分析 DNA模板中存在抑制剂 重新纯化模板或降低模板使用量 Mg2+浓度不合适 使用2×SuperReal SYBR PCR Mix Plus时，PCR反应体系中Mg2+的终浓度为2mM。
对有些扩增体系，可以将Mg2+终浓度提高到5mM。
进行Mg2+终浓度优化时，建议每次增加0.5mM Mg2+浓度进行实验。加样错误或试剂问题 检查试剂浓度和保存条件，包括所使用的引物和模板。重复进行实验。 热启动酶未能激活 使用试剂时，请确保预变性条件为95℃ 15min，用以有效激活热启动DNA聚合酶。 PCR条件、引物序列或浓度不当 请确认引物未发生降解，引物浓度及PCR条件，扩增不好时，通常先尝试降低退火温度，
延长退火时间和提高引物浓度，有时也可以提高退火温度，增加延伸时间，降低升温速度。
对于GC含量高的模板，可以适当延长变性时间。
如果还是扩增不好，请重新设计引物。起始模板问题 检查起始模板的浓度，保存条件和质量。
重新对模板进行线性梯度稀释，并用新稀释模板进行实验。
增加起始模板使用量。 - NTC出现较高的荧光值
问题 分析 试剂污染 建议使用新试剂进行实验。 PCR反应液配制时发生污染 采取必要的防污染策略(如使用带滤芯的枪头)。 引物出现降解 可以使用变性聚丙烯酰胺胶检测引物降解情况。 - 出现引物二聚体和(或)非特异扩增
问题 分析 Mg2＋浓度不合适 使用2×SuperReal SYBR PCR Mix Plus的反应体系含有Mg2＋的终浓度为2mM。
对有些扩增体系，可以将Mg2＋终浓度增加到5mM。建议每次增加0.5mM Mg2＋浓度进行优化。PCR退火温度太低 建议每次增加2℃进行退火温度优化。 引物设计不合适 考虑重新设计引物序列。 PCR产物太长 荧光定量PCR产物长度适宜在100～150bp之间，而且不应该超过500bp。 引物出现降解 可以使用变性聚丙烯酰胺胶检测引物降解情况。 计量误差 反应体积太小会导致检测精度下降。请根据定量PCR仪推荐的反应体积重新实验。 - 定量值重现性差
问题 分析 仪器方面的故障 因为仪器的不适用，在温度管理或检测时产生重现性差。请根据相应仪器的说明书进行点检。 样品纯度不好 不纯的样品会导致实验的重现性差。 稀释的模板放置太久 通过梯度稀释的模板最好现配现用。 引物质量下降 尽量避免新合成引物批次间的差异，可以使用原来质量好的引物做为对照。 PCR反应条件、引物浓度、序列等不恰当 扩增效率差的PCR较容易产生重现性差。通过变更引物的浓度或PCR反应条件来进行调整。扩增不好时，一般可降低退火温度或提高引物浓度，也可以延长延伸时间。如模板的GC含量较高，可延长变性时间。仍得不到改善时，建议重新设计引物。 计量误差 反应体积太小会导致检测精度下降。请根据定量PCR仪推荐的反应体积重新实验。
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